无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）
物种名：无乳链球菌
拉丁学名：Streptococcus agalactiae
分类学地位：细菌界Bacteria；芽孢杆菌门Bacillota；
芽孢杆菌纲Bacilli；乳酸杆菌目Lactobacillales；
链球菌科Streptococcaceae；链球菌属Streptococcus
无乳链球菌是一种革兰氏阳性链球菌，因最先从患乳腺炎病牛乳汁中首次分离而命名。随后在各国孕产妇和新生儿中分离到，可引起新生儿早发和晚发型感染，无乳链球菌也被发现于各种畜牧及水产鱼类的流行病中，因此受到广泛关注。该菌能导致动物体产生败血症和脑膜炎，且具有较高的致死率[1]。
1.1生物学特性
1.1.1培养特征
在培养特性方面，无乳链球菌在血琼脂平板上，于35℃-37℃下培养18-24小时后，可以形成灰白色、表面光滑、有乳光、圆形、边缘整齐的菌落。其最典型的特征是菌落周围具有狭窄的β溶血环（菌落直径与溶血环大小呈正比，这与化脓性链球菌明显不同，后者的溶血环通常是菌落的2-4倍）。菌落直径可以达到1 mm，通常大于A群链球菌。需要注意的是，约有1%-2%的无乳链球菌菌株可能不产生β溶血环，而少数菌株则可以形成较宽的溶血环（图1）[6]。
图1 无乳链球菌血平板菌落形态[6]
1.1.2形态学特征
无乳链球菌是革兰氏阳性菌。在显微镜下，无乳链球菌呈现单个、成双、短链（通常小于6个）或长短不一的链状排列。该菌无鞭毛、无芽孢、无运动性，部分致病菌株具有荚膜。在患者的血培养阳性标本或液体培养基中，这种细菌常呈现特征性的链状排列（图2）[7]。
图2 无乳链球菌革兰氏染色结果[7]
1.1.3生化特征
无乳链球菌能够分解多种糖类，包括但不限于葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖。这些糖类在无乳链球菌的代谢过程中可以被分解和利用，为细菌的生长和繁殖提供能量和碳源。无乳链球菌对不同的糖类分解能力可能有所不同，具体能够分解哪些糖类取决于菌株的特性和环境条件，但不能分解山梨醇。此外，无乳链球菌在分解糖类的过程中，还可能产生一些代谢产物，如有机酸等，这些代谢产物对于细菌的生长和代谢也具有重要作用。此外无乳链球菌还能进行以下生化反应：
（1）触酶试验：无乳链球菌的触酶反应为阴性，意味着这种细菌不能分解过氧化氢。
（2）CAMP试验：无乳链球菌能够产生CAMP因子，因此CAMP试验阳性[3]。
（3）VP试验：无乳链球菌在VP试验中同样呈现阳性反应。VP试验，即Voges-Proskauer试验，是一种检测细菌发酵葡萄糖产生丙酮酸的方法。无乳链球菌在发酵葡萄糖的过程中能够产生丙酮酸，因此VP试验阳性。
1.1.4分子生物学特征
无乳链球菌致病性的强弱主要与其致病因子密切相关，目前研究结果表明，其最主要的致病因子主要有荚膜多糖、FbsA蛋白、溶血素、AIP蛋白家族、CAMP因子和SIP蛋白等。
（1）荚膜多糖：荚膜多糖（CPS）是无乳链球菌的一种主要的毒力致病因子，具有黏附和定植作用，由半乳糖、葡萄糖、氨基葡萄糖和唾液酸4种组分构成，经由若干个单糖组分彼此连接构成重复单元，一定数目的重复单元按特定的方式聚合形成荚膜多糖。通常情况下，病原菌表面的CPS能够起到逃逸被宿主机体内的免疫活性物质清除的作用，如体内的溶菌酶和抗体等，使得菌株往往能够穿过动物机体的第一道免疫防线，避免了被吞噬细胞吞噬降解[2]。
（2）CAMP因子：CAMP因子是无乳链球菌合成并分泌的一种胞外蛋白因子，由cfb基因编码，分子大小约为25300。CAMP因子介导的CAMP反应，即在金黄色葡萄球菌分泌的鞘磷脂酶的作用下，溶解红细胞膜表面的鞘磷脂，降低细胞膜的稳定性，CAMP因子进一步作用于红细胞膜，引起红细胞膜裂解，产生的溶血反应，溶血区域呈箭头状。cfb基因缺失的无乳链球菌突变株在绵羊血琼脂平板上与金黄色葡萄球菌垂直划线培养时，不能发生CAMP反应，导入cfb基因后又重新恢复CAMP反应。CAMP试验呈阳性，并结合常规生化试验反应判定标准，可作为鉴别无乳链球菌感染的有效标准。CAMP因子不具有酶活性，其单体可以结合并寡聚细胞膜组分，穿透细胞膜[3]。另有研究指出，CAMP因子能与免疫球蛋白IgG和IgM的Fc区域结合[4]，降低机体的免疫功能。
（3）AIP蛋白家族：AIP蛋白系列包括α、RiB、R28和AIP2蛋白，统称为α-相关蛋白。在无乳链球菌菌体表面的保护性蛋白中，首先被鉴定出来的是α和β两种分子，其中α蛋白对胰蛋白酶耐受，而β蛋白则对胰蛋白酶敏感[5]。这两种蛋白在无乳链球菌侵染宿主的过程中，菌株可以同时表达2种或其中1种蛋白，在由荚膜Ⅲ型无乳链球菌引起的大部分侵袭性感染中，菌株几乎从不表达α和β蛋白[6]。α蛋白在Ⅰa、Ⅰb和Ⅱ型血清型菌株中表达广泛，在Ⅲ型菌株中暂未有α蛋白的报道。RiB蛋白是一种免疫保护性抗原，常与无乳链球菌感染密切相关，序列分析表明，RiB蛋白具有一段由55个氨基酸残基构成的信号肽和12个重复单元，每个重复单元包含79个氨基酸残基，这占据了成熟RiB蛋白质序列的80%以上。R28蛋白最早从化脓性链球菌中检测出来，后在Ⅴ和Ⅷ血清型无乳链球菌中也相继分离出R28蛋白，且两种血清型菌株表达的R28蛋白在蛋白质一级结构水平上具有高度的一致性。AIP2蛋白首先从Ⅴ型血清型无乳链球菌鉴定出来，在AIP2蛋白家族中的含量最少，除了Ⅰa、Ⅲ和Ⅴ型菌株，目前在其他血清型无乳链球菌中尚未有AIP2蛋白的报道。
（4）溶血素：溶血素又称为细胞溶素，是细菌合成、分泌的一种能使细胞裂解死亡的生物活性物质。β-溶血素在Ａ群链球菌（GAS）、无乳链球菌和停乳链球菌的感染过程中起关键作用，该溶血素的过量表达与临床上无乳链球菌疾病的暴发流行密切相关[7]。这些菌群最显著的表型特征是在血琼脂平板上培养时，菌落周围能产生明显的β-溶血区域，因此，β-溶血作为表型特征已经被广泛用于临床实验室初步鉴定化脓性链球菌，尽管大多数链球菌具有类似的β-溶血现象，但不同β-溶血素分子的微观结构差异很大[8]。菌体表面的β-h/c使得无乳链球菌能在血琼脂平板上表现出典型的狭窄的β-溶血区，能溶解大多数真核细胞，在无乳链球菌发病机理中发挥重要作用。
1.2分布、传播与致病性
1.2.1分布与传播
无乳链球菌主要寄生于女性生殖道和胃肠道。在孕妇中，无乳链球菌的带菌率较高，约为10%-30%。此外，它也存在于乳牛的皮肤、乳头和乳房内，可能通过挤乳人员的手或挤乳机械以及蚊蝇类的机械携带而传播。
无乳链球菌的传播途径主要包括垂直传播、性传播和间接传播。垂直传播是最常见的传播方式，如果孕妇感染了无乳链球菌，在分娩过程中，新生儿可能通过吸入感染的羊水或通过产道时感染。性传播也是无乳链球菌传播的一种方式，因为它主要寄生于女性生殖道和尿道。此外，间接传播也可能发生，例如通过接触污染的医疗器械或手。
无乳链球菌在感染后不产生明显的免疫力，因此人群普遍易感，新生儿、孕妇、老年人等免疫力较低的人群感染风险较高。无乳链球菌可引起多种疾病，包括乳腺炎、新生儿肺炎、脑膜炎和败血症等，因此及时诊断和治疗无乳链球菌感染对于保护人群健康具有重要意义。
1.2.2致病性
（1）无乳链球菌对人的致病性
无乳链球菌在自然环境中普遍存在，可寄居于人体泌尿生殖道和消化道，是人和动物的主要致病菌之一。人源性无乳链球菌主要引起妇女子宫内膜炎和婴幼儿脑膜炎、败血症及肺炎，临床研究表明孕妇感染率较高。有研究表明，在成年女性中，无乳链球菌的发病率有所增加，这些病例大多见于有糖尿病、神经损伤、乳腺癌和肝硬化等疾病的人群。65岁以上成人死于侵袭性无乳链球菌病的危险性最高，而且无乳链球菌引起男性和非妊娠女性泌尿生殖道的感染，也越来越受到医务人员的重视。当今做好婴幼儿科无乳链球菌感染的预防监管和孕产妇感染的筛查与治疗工作仍是欧美国家防治该病的首要任务。近年来无乳链球菌在人群中的扩散趋势有所上升，尤其是引起新生儿的感染。
（2）无乳链球菌对奶牛的致病性
无乳链球菌是引起奶牛乳房炎的最主要病原菌，可引起乳房红肿、硬结、血乳、乳汁水样变性等，含菌量可达到5×108 CFU/mL，导致产奶量急剧下降，乳品质量降低，严重时甚至可使乳房报废，给奶牛养殖业造成严重的经济损失[9]。
（3）无乳链球菌对罗非鱼的致病性
罗非鱼是一种世界性优良品种的养殖鱼类，有着可观的经济效益，我国东南沿海等地已形成规模化养殖。随着养殖规模的扩大和管理方法的不当，罗非鱼养殖场疫病频发，尤其是由链球菌引起的疫病造成大批罗非鱼死亡，对水产养殖业造成严重的经济损失。该菌主要感染部位是鱼脑部，感染初期往往无症状，患鱼病程短，出现症状时已不能进食，死亡率高，一般表现为转圈游动，眼球突出且常呈浑浊样。
1.3检测方法
（1）细菌培养鉴定法：临床最常用的是阴道-直肠拭子培养。孕妇在怀孕35~37周时采集样本，接种于选择性显色培养基（如Todd-Hewitt肉汤）中增菌，再转接血平板观察溶血性及生化反应。这是诊断的金标准。
（2）血清学检测：利用乳胶凝集试验直接检测样本或纯培养物中的GBS特异性抗原，速度快但灵敏度受细菌浓度影响。
（3）实时荧光定量PCR（qPCR）方法：分子检测具有灵敏度高、特异性强、耗时短（2小时内）的优势。临床和流行病学检测中，通常靶向无乳链球菌高度保守的CAMP因子编码基因（cfb基因）进行定量扩增[10]。通过提取阴道分泌物、羊水或水产组织中的DNA，加入上述引物进行扩增。该方法不仅能早期确诊，还能通过循环阈值（Ct值）定量评估标本中的细菌载量。
表1无乳链球菌cfb基因定量PCR引物和探针表
| 引物/探针类型 | 序列（5′→3′） |
| 正向引物 | TTTCACCAGCTGTATTAGAAGTA |
| 反向引物 | GTTCCCTGAACATTATCTTTGAT |
| TaqMan探针 | FAM-TGCCACTAAGTGCAGATTCATCTAGA-TAMRA |
1.4典型案例
2009年至2010年夏季，我国广东、海南、广西等地的罗非鱼主产区暴发了大规模的链球菌病[9]，导致局部地区养殖鱼类死亡率高达80%，经济损失极其惨重。病原学分离鉴定确证致病菌为无乳链球菌。受感染的罗非鱼表现为离群独游、眼球突出充血、身体发黑以及游动失衡等典型的脑膜炎症状。无乳链球菌是一种条件致病菌，其暴发与水环境的恶化具有决定性的关系。夏季持续的高温（水>30℃）不仅加速了细菌在水体和底泥中的大量繁殖，还导致水体溶解氧急剧下降。低氧环境严重抑制了罗非鱼的非特异性免疫功能，使其处于高度应激状态。同时，高密度养殖投喂了大量饲料，未吃完的残饵和鱼类排泄物在池底积累，使水体富营养化并产生大量氨氮和亚硝酸盐。无乳链球菌在富含有机物的水环境中极易存活。并且，含有高浓度细菌的水体成为了直接的传染媒介。病原菌通过受损的鱼鳃、体表伤口或摄食过程中的胃肠道黏膜侵入鱼体血液循环，穿越血脑屏障引发致命感染。同时，发病池塘未彻底消毒的尾水排放，又污染了周边水源，导致疫情在不同池塘间通过水体迅速蔓延。
1.5防治对策
（1）水源管理：确保养殖用水来自清洁、无污染的水源。对进入养殖系统的水进行过滤和消毒，以减少或消除无乳链球菌的进入。
（2）水质监测：定期监测养殖水体的水质，包括pH值、温度、溶解氧、氨氮等关键指标。这些参数的异常可能导致无乳链球菌的繁殖和扩散。
（3）生物安全措施：在养殖过程中，实施严格的生物安全措施，如限制人员、工具和设备的交叉使用，以减少无乳链球菌的传播。
（4）养殖密度管理：避免过高的养殖密度，以减少养殖系统内的压力，提高鱼类的抵抗力，从而降低无乳链球菌感染的风险。
（5）饲料管理：提供均衡、高质量的饲料，以增强鱼类的免疫力，提高对无乳链球菌的抵抗力。
（6）疾病监测与防控：定期监测养殖鱼类的健康状况，及时发现并处理无乳链球菌感染。对于已经感染的养殖池，可以采用适当的消毒剂或抗生素进行治疗，但要注意药物使用的合规性和安全性。
（7）环境改善：优化养殖环境，如增加水体的流动性和氧气含量，有助于减少无乳链球菌的繁殖和生存。
（8）培训与宣传：加强对养殖人员的培训，提高他们的疾病防控意识和技能。同时，向公众宣传无乳链球菌的危害和防控知识，提高公众的认知度和参与度。
参考文献
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[10] Ke D, Ménard C, Picard FJ et al. Development of conventional and real-time PCR assays for the rapid detection of group B streptococci. Clinical Chemistry, 2000, 46: 324-331.
[11] Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Streptococcus_agalactiae.