龟分枝杆菌（Mycobacterium chelonae）
物种名：龟分枝杆菌
拉丁学名：Mycobacterium chelonae
分类学地位： 细菌界Bacteria；分枝杆菌门Actinobacteria；
放线菌纲Actinobacteria；分枝杆菌目Actinomycetales；
分枝杆菌科Mycobacteriaceae；分枝杆菌属Mycobacterium
龟分枝杆菌（Mycobacterium chelonae）属于非结核分枝杆菌中的快速生长分枝杆菌，广泛存在于自然环境和人工水环境中，可引起皮肤、软组织、术后切口、导管相关感染，也可在免疫功能低下者中引起播散性感染[1, 2]。其感染常与外伤、侵入性医疗操作、污染水源或宿主局部防御受损有关，临床上容易与普通细菌感染、结核分枝杆菌感染或其他慢性肉芽肿性疾病混淆，因而增加了诊断与治疗难度[2, 3]。
1.1生物学特性
1.1.1培养特征
龟分枝杆菌为专性需氧菌，属于快速生长分枝杆菌。与结核分枝杆菌等缓慢生长菌不同，其在适宜条件下通常可于3-7 d内在固体培养基上形成可见菌落[2][5]。常用培养基包括血平板、Middlebrook 7H10/7H11培养基以及Lowenstein–Jensen培养基；部分菌株也可在麦康凯琼脂上生长（图1）。菌落多呈圆形、光滑或稍粗糙、湿润、有光泽，不产色或呈乳白色、淡黄色[4, 5]。
龟分枝杆菌对温度具有一定适应范围，临床分离株多可在25-37℃生长，最常用的实验室培养温度为30-35℃或35-37℃[1, 4]。因其生长速度快于多数分枝杆菌，实验室在怀疑快速生长分枝杆菌时应缩短初筛观察等待时间，并结合菌落形态、抗酸染色和后续分子鉴定综合判断。
图1 龟分枝杆菌在各种平板上的培养结果
A：麦康凯琼脂培养基[4]，B：血平板[5]
1.1.2形态学特征
龟分枝杆菌为专性需氧菌，属于快速生长分枝杆菌。与结核分枝杆菌等缓慢生长菌不同，其在适宜条件下通常可于3-7 d内在固体培养基上形成可见菌落。常用培养基包括血平板、Middlebrook 7H10/7H11培养基以及Lowenstein–Jensen培养基；部分菌株也可在麦康凯琼脂上生长（图1）。龟分枝杆菌为细长或略弯曲的抗酸杆菌，大小一般约为0.2-0.6 μm × 1-6 μm，在镜下可见单个散在、成对或短链状排列（图2）。其细胞壁富含分枝菌酸和其他脂质成分，因此具有典型抗酸性。采用Ziehl–Neelsen抗酸染色后，菌体可呈红色，而背景多呈蓝色[1, 6]。
龟分枝杆菌细胞壁脂质含量高，这一结构既影响其染色特征，也与其环境耐受性和药物敏感性有关。部分研究提示其细胞表面还可存在外层包被结构，但在常规制片过程中不易稳定观察到，因此不宜将“荚膜”作为本菌固定、核心的形态学鉴定特征来表述。菌落多呈圆形、光滑或稍粗糙、湿润、有光泽，不产色或呈乳白色、淡黄色。
龟分枝杆菌对温度具有一定适应范围，临床分离株多可在25-37℃生长，最常用的实验室培养温度为30-35℃或35-37℃[1, 4]。因其生长速度快于多数分枝杆菌，实验室在怀疑快速生长分枝杆菌时应缩短初筛观察等待时间，并结合菌落形态、抗酸染色和后续分子鉴定综合判断。
图2 龟分枝杆菌培养显微镜照片[6]
1.1.3生化特征
龟分枝杆菌属于快速生长非结核分枝杆菌，其传统生化鉴定常结合芳香硫酸酯酶试验、硝酸盐还原试验、铁吸收试验、生长温度范围和麦康凯琼脂生长情况等综合判断[1, 4]。一般而言，龟分枝杆菌可在3 d芳香硫酸酯酶试验中呈阳性，而硝酸盐还原试验和铁吸收试验多为阴性，这有助于其与部分其他快速生长分枝杆菌鉴别[4, 8]。
需要注意的是，原先用于结核分枝杆菌毒力解释的“索状因子、蜡质 D、硫酸脑苷脂”等内容，不宜不加区分地整体套用于龟分枝杆菌。本节应重点保留与实验室鉴别直接相关的生化性状，而不应混入过多针对结核分枝杆菌复合群的经典毒力表述[1, 7]。
1.2分布、传播与致病性
1.2.1分布与传播
龟分枝杆菌的种水平鉴定目前主要依赖分子方法。常用靶基因包括16S rRNA、hsp65和rpoB，其中hsp65 PCR-RFLP、hsp65测序和rpoB测序在快速生长分枝杆菌的鉴定中应用较多。相比单纯依赖传统生化反应，分子检测在区分龟分枝杆菌与脓肿分枝杆菌复合群等近缘菌种方面更具准确性[9, 10]。
若在临床样本或培养物中检测龟分枝杆菌，可先使用分枝杆菌属通用靶标进行筛查，再结合hsp65或rpoB物种鉴定序列进行确认[9, 11]。这些方法不仅提高了物种鉴定速度，也有助于后续药敏解释和治疗决策。
1.2.2致病性
龟分枝杆菌最常引起的临床类型为皮肤和软组织感染，如局部红肿、硬结、脓肿、窦道形成、慢性不愈合伤口等；也可引起手术切口感染、角膜炎、滑膜炎、骨感染和导管相关感染[2, 3 13]。在长期使用糖皮质激素、器官移植、恶性肿瘤、长期透析或其他免疫功能低下患者中，龟分枝杆菌还可能导致播散性感染[3, 13]。
本菌致病性与其细胞壁脂质屏障、胞内生存能力及环境适应性有关。其脂质丰富的细胞壁可降低药物和消毒剂进入细胞的效率，同时增强其在宿主和外界环境中的存活能力[1, 7]。不过，与结核分枝杆菌相比，龟分枝杆菌更应被视为环境机会致病菌，其致病多依赖宿主屏障受损、局部操作和污染暴露，而不是像结核分枝杆菌那样以典型呼吸道传播为主。
1.3检测方法
（1）传统检测方法：龟分枝杆菌传统检测以体外培养结合生化反应为主：将血液、脓液、组织等标本集菌处理后，接种于血琼脂、麦康凯琼脂或 Middlebrook固体培养基，该菌营养要求低，在30-35℃需氧培养2-7天、37℃培养25天均可形成无色圆形、光滑或粗糙的突起菌落；培养物涂片染色可见革兰阳性杆菌、抗酸染色阳性。生化鉴定方面，菌株可在 TCH、PNB 培养基正常生长，耐受5 μg/mL NAP，符合快速生长分枝杆菌特征；其芳香硫酸酯酶试验3天、14天结果均为阳性，硝酸盐还原试验、铁吸收试验均为阴性，多数菌株可在麦康凯琼脂生长，所有菌株均无法在45℃环境生长，依据上述特征可与其他快速生长分枝杆菌区分。
（2）分子生物学检测与定量PCR（qPCR）
定量荧光PCR（qPCR）方法：针对龟分枝杆菌rpoB基因的保守特异性区域，采用基于SYBR Green I染料法的实时荧光定量PCR体系，使用引物，配置20μL 反应体系（含2 × SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μm，DNA模板2 μL，无核酸酶水补足至 20 μL）后在荧光定量PCR仪上扩增。反应程序为：95℃预变性5 min；随后40个循环（95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，此阶段采集荧光信号），反应结束后进行熔解曲线分析，龟分枝杆菌特异性产物通常在80℃-85℃之间形成单一特征性熔解峰。该方法可排除引物二聚体干扰，最低检测限可达数十个拷贝，适合微量病原体的早期快速诊断与致病载量分析[8, 11]。
表1 龟分枝杆菌实时荧光定量PCR引物与探针序列
| 基因 | 名称 | 序列（5′→3′） | |
| rpoB | 上游引物 | TCAAGGAGAAGCGCTACGA | |
| 下游引物 | GGATGTTGATCAGGGTCTGC | ||
1.4典型案例
2009年5月11日至7月22日，某医院发生8例妇科患者腹腔镜术后切口龟分枝杆菌感染事件（经后续流行病学扩大排查，最终确认13例类似感染）。这些患者主要接受了宫外孕输卵管切除术或卵巢囊肿切除术。患者的发病时间集中在术后9-30天（平均19.54天），临床表现以手术切口轻度红肿、皮下硬结、少量渗出为主，个别切口形成经久不愈的窦道，但患者均无明显发热症状。初期临床盲目使用头孢菌素类抗菌药物及常规换药理疗，均未取得明显疗效[13]。经流行病学及现场卫生学调查，本次医源性暴发感染的原因系医疗器械消毒不彻底及冲洗用水污染所致。龟分枝杆菌属于非结核分枝杆菌中的环境机会致病菌，广泛定居于自然水体和管网系统中。该菌细胞壁富含分枝菌酸及大量脂质层，对低浓度戊二醛和含氯消毒液等常用化学消毒剂表现出较强耐受性。在此案例中，由于腹腔镜器械管腔复杂，人工清洗未能彻底去除缝隙残留物，加之戊二醛浸泡时间不达标，以及冲洗用水中可能潜藏了水生微生物，导致残存的龟分枝杆菌在此类有创操作中直接被植入患者缺乏防御屏障的腹壁切口组织，进而引发暴发性术后感染[12, 13]。
2012年10月，一名65岁女性农民因左小腿出现皮下结节、红肿及腹股沟淋巴结肿大2个多月前往医院就诊。查体显示，左小腿内侧存在一5.0 cm × 3.0 cm 大小的慢性脓肿灶，表面破溃并伴有少量淡红色稀薄分泌物；左侧腹股沟可触及多枚肿大淋巴结。患者体温正常，血常规基本正常，PPD试验（++），肺部CT未见异常。患者在当地接受普通抗感染治疗十余日无效。随后，医院切除其伤口炎性组织并进行直接涂片，经抗酸染色检出强阳性杆菌，病灶分泌物培养及后续分子鉴定最终确诊为龟分枝杆菌感染。追溯病史发现，该患者在发病前3个月于田间劳作时曾遭受明确的左小腿外伤。由于龟分枝杆菌是典型的环境定植菌，广泛分布于泥土、灰尘及自然水源中。正常情况下，完整的人体皮肤能够有效抵御其侵袭，但田间劳作引发的创伤破坏了这一物理防御屏障。环境中的病原菌借机通过伤口直接接种入皮下软组织，利用其致密的脂质屏障在宿主巨噬细胞内逃避溶酶体的杀灭作用，从而缓慢增殖。这种典型的外伤与环境职业暴露相叠加，最终演变成了以慢性结节、冷脓肿和局部淋巴结肿大为特征的软组织难治性肉芽肿感染[3, 16]。
1.5防治对策
（1）龟分枝杆菌对红霉素、头孢菌素类、四环素、阿米卡星、头霉素较为敏感。在临床上龟分枝杆菌感染确诊以后，通常采用红霉素、头孢菌素类药物进行正规彻底的治疗。
（2）此菌对一线抗结核药物的耐药性较高，所以临床上大都采用联合用药。本例患者采取阿米卡星、克拉霉素、头孢西丁、利福平联合用药，并对脓肿部位进行清创治疗。治疗一段时间后胸部CT显示双肺纹理较以前清晰，B超检查提示局限性脓肿缩小，微生物学检查表明多次送检血培养呈阴性[2]。
（3）主要通过呼吸道以及接触传染，故预防措施应针对病因进行，在有感染流行期间，应佩戴口罩以及手套，以减少呼吸道和皮肤接触的可能。如果有可疑接触者，可口服红霉素预防。
（4）国家和政府应出台相应的水生态管理法，严格管控工业废水、污水的排放，防治对水环境造成污染，致病微生物大量繁殖。
参考文献
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