水环境常见致病生物图谱系统

埃可病毒

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由

IOAG
于

埃可病毒（echoviruses）

物种名：埃可病毒

拉丁学名：echoviruses

分类学地位：

界：病毒界（Viri）

科：小RNA病毒科（Picornaviridae）

属：肠道病毒属（Enterovirus）

埃可病毒(ECHO)（ECHO-viruses）病毒即肠性细胞致病性人类孤独型病毒（enteric cytopatho-genic human orphan virus），只对人类有感染性，多发于夏、秋季，绝大多数是隐性感染。ECHO病毒分为30多个型（1~34型，其中8、10、28、34型已归入其他病毒）。各型致病力和致病类型也不同，如ECHO6、19型致病力较强，它类似于柯萨奇病毒B型引起急性胸痛和心肌病。

1.1生物学特性

1.1.1培养特征

使用DMEM细胞完全培养基[包括89% (v/v) DMEM High Glucose培养液, 10% (v/v) 胎牛血清, 1% (v/v) 青链霉素双抗]在T75细胞培养瓶及滚瓶中，传代培养RD细胞。细胞密度达到80%, EC30病毒以0.1 (Pfu number/cell) 的感染复数感染细胞。显微镜下观察90%以上的细胞出现细胞脱落等病变效应时, 收取病毒液, 保存于-80℃冰箱中。

取-80℃冻存的EC30病毒液400 mL, 反复冻融3次后。4℃4 000 rpm离心30 min, 收集上清。再经过校正浓度、搅拌、离心等步骤[1]，如图1所示。

电泳检测蔗糖梯度分离EC30病毒

图1 SDS-PAGE电泳检测蔗糖梯度分离EC30病毒。目的产物成熟病毒颗粒集中在22-27号管中

1.1.2形态学特征

对病毒颗粒浓缩样品，进行蛋白质定量分析后， 取少量样品配制为浓度为0.5mg/mL的溶液, 将5μL该溶液滴于铜网 (74μm镀碳支持膜)，1分钟后使用滤纸吸去支持膜上残余液体, 使用5μL醋酸双氧铀染色液对支持膜进行染色, 染色时间为1 min,吸干残余染液, 红外烘烤灯烘干铜网后，用场发射低温冷冻透射电镜对样品进行电镜观察，选取收集含有成熟病毒颗粒的组分, 使用蛋白质超滤管进行浓缩, 期间添加10 mM Tris (p H 7.4) 缓冲液置换溶液。最终获得病毒颗粒蛋白浓度2.5 mg/mL。SDS-PAGE胶电泳考马斯亮蓝染色结果如图所示 (图2A) , 可见高纯度病毒颗粒 (virion) 条带, 分子量与预期结果一致。目的产物用透射电镜观察 (图2B)，发现大部分产物以30 nm左右直径的球形颗粒的形式存在;未正确包装的病毒颗粒所占比例极少, 暗示该方法获得病毒颗粒质量高且颗粒大小均一。获得高纯度的埃可30型病毒后, 使用Hampton试剂盒筛选优化晶体生长条件。经对比研究后发现病毒蛋白在浓度为2.5 mg/mL, 0.2 M Sodium chloride,0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6, 30%v/v (+/-) -2-Methyl-2, 4-pentanediol的结晶条件下, 得到如图3所示高质量晶体[1]。

EC30成熟病毒颗粒纯化的负染色电镜结果

图2 EC30成熟病毒颗粒纯化的负染色电镜结果

EC30成熟病毒颗粒的晶体

图3 EC30成熟病毒颗粒的晶体

1.1.3生化特征

埃可病毒18型(E-18)是一种无包膜的单股正链RNA病毒，其基因组全长约7 400个核苷酸，有单一含6 570个核苷酸的开放阅读框架，编码一个由2 189个氨基酸组成的多聚蛋白质[2,3]。该多聚蛋白质可裂解为3个蛋白质前体P1、P2和P3，并可以继而裂解成11种蛋白，分别为VP1-VP4、2A-2C和3A-3D。其中主要抗原决定簇位于VP1蛋白上。

1.1.4 分子生物学特征

采用BioEdit 7.2.3进行核苷酸和氨基酸序列排列。通过MEGA 7.0[4]进行E16毒株、所有E病毒和其他部分EV-B毒株的分析。对数据进行1 000次重复，采用Simplot 3.5.1软件，以200nt为单位，以20nt为步长移动并作Jukes-Cantor校正[5]，进行similarity plot和bootscanning分析。参照Harrington毒株已公布的序列设计全基因组扩增引物。引物设计采用“primer-warking”策略[6],PCR产物采用ABI 3730XL自动测序仪测序。PCR扩增和测序引物列见表1。

表1 埃可病毒全基因组序列扩增及测序引物

埃可病毒全基因组序列扩增及测序引物

1.2分布、传播与致病性

1.2.1 分布与传播

主要通过口-粪途径传播，也可以通过咽喉分泌物排出病毒，经呼吸道传播。病毒进入人体后，在咽部及肠黏膜细胞增殖后侵入血流，形成病毒血症。

1.2.2 致病性

埃可病毒感染的临床表现类似于风疹，第一孕季感染虽可累及胎儿，但很少引起畸形。皮疹为斑丘疹或麻疹样皮疹，持续1～3天自然消退。

临床诊断病例①发热、头痛、频繁呕吐、精神萎靡。②脑膜刺激征：颈强直、克氏征和布氏征阳性[7]。

1.3检测方法

1.全基因组测序

参照Harrington毒株已公布的序列设计全基因组扩增引物。引物设计采用“primer-warking”策略

2.序列分析和重组分析

3.荧光定量PCR

1.4典型案例

2010年6月福建省龙岩市长汀县发生一起由肠道病毒ECHO6型引起的儿童病毒性脑炎暴发流行[8]。

2012年5—6月, 萧山区某小学A班发生一起以发热 ( ≥38℃ ) 、头痛为主, 个别伴有呕吐为临床症状的不明原因疾病暴发。

2015年3月~2016年7月在昆明市妇幼保健院就诊, 临床诊断为HFMD的患儿51例。

1.5防治对策

（1）加强教室、卧室、等生活场所卫生与通风, 周边地区开展应急监测。

（2）使用安全的饮用水和食物原料，改善卫生习惯，避免造成埃可病毒的污染。

（3）生产加工乳制品、肉类等食品的企业以及自来水公司，应严格的执行食品安全国家标准的相关规定。

参考文献

  1. 何娅玲. 一种高效分离埃可病毒30型病毒颗粒及其晶体培养方法的建立 [J]. 中外医疗, 2018, 37 (27): 15-17. DOI:10.16662/j.cnki.1674-0742.2018.27.015.
  2. Chen XP,Sun SZ,Guo JY,et al.Complete genome sequence analysis of echovirus 18 associated with aseptic meningitis in Hebei Province,China,in 2015 [J].Genome Announc,2016,4(5):e01165-16.
  3. Chen X,Ji T,Guo J,et al.Molecular epidemiology of echovirus 18 circulating in mainland China from 2015 to 2016 [J].Virol Sin,2019,34(1):50-58.
  4. Kumar S,Stecher G,Tamura K.MEGA7:molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J].Mol Biol Evol,2016,33(7):1870-1874.
  5. Lole KS,Bollinger RC,Paranjape RS,et al.Full-length human immunodeficiency virus type 1 genomes from subtype C-infected seroconverters in India,with evidence of intersubtype recombination[J].J Virol,1999,73(1):152-160.
  6. Kaczorowski T,Szybalski W.Genomic DNA sequencing by SPEL-6 primer walking using hexamer ligation[J].Gene,1998,223(1-2):83-91.
  7. 马芳,李明星,李丽,等. 宁夏一起埃可病毒9型病毒性脑膜炎暴发疫情的流行病学分析[J]. 宁夏医科大学学报,2011,33(1):44-47. DOI:10.3969/j.issn.1674-6309.2011.01.015.
  8. 陈前进, 杨秀惠, 罗招福, 等.一起埃可6型病毒所致儿童病毒性脑炎暴发的流行病学调查[J].中华预防医学杂志, 2011, 45 (11) :1052-1053.