犬新孢子虫（Neospora caninum）
物种名：犬新孢子虫
拉丁学名：Neospora caninum
分类学地位：真核生物界Eukaryota；顶复门Apicomplexa；
孢子虫纲Sporozoa；真球虫目Eucoccidiorida；
肉孢子虫科Sarcocystidae；新孢子虫属Neospora
犬新孢子虫（Neospora caninum）是一种致死性胞内寄生原虫，最早是由Bjerkas于1984年在患脑膜炎和肌炎的幼犬体中发现，并由Dubey于1988年根据其形态特征命名。新孢子虫可感染犬、牛等多种动物，寄生于宿主体内可导致孕畜流产或产死胎以及新生幼畜运动神经障碍和神经系统疾病等，给养殖业带来巨大损失。
1.1生物学特性
1.1.1生活史
犬新孢子虫的生活史尚未完全阐明，其发育过程需要两个宿主：在终末宿主（目前仅发现为犬）体内进行球虫型发育，在中间宿主（牛、羊、兔、马、猪、小鼠和大鼠等）体内进行肠外期发育。感染犬随粪便排出未孢子化的卵囊，卵囊在外界环境中经24小时孢子化后才具感染性。中间宿主吞食孢子化卵囊后，子孢子在消化道释放，随血液到达全身多种有核细胞内发育成速殖子并进行分裂增殖。一段时间后，部分速殖子繁殖变慢，在脑、神经和视网膜等组织中形成包囊（内含缓殖子）。当犬吞食了含有包囊的牛胎盘、胎衣或死胎儿组织后，缓殖子在犬小肠内释放并进行球虫型发育，最终以卵囊形式随粪便排出体外。此外，经胎盘途径发生的垂直传播是该虫的重要传播途径[1]。
1.1.2形态学特征
犬新孢子虫在生长发育过程中典型的形态有速殖子（Tachyzoites）、组织包囊（Tissue Cysts）和卵囊（Oocysts）。速殖子和组织包囊是存在于中间宿主体内的阶段，且均发生于细胞内。速殖子为卵圆形、月牙形或球形，大小约为6×2 µm。组织包囊通常呈圆形或椭圆形，长度可达107 µm，主要存在于宿主动物的中枢神经系统。组织包囊囊壁厚度可达4 µm，其内所含的缓殖子（Bradyzoites）大小为（7-8）×2 µm，包囊内常有管泡状结构，主要寄生于脊髓和大脑中。神经外组织，尤其是肌肉组织也可能含有组织包囊[3, 4]。卵囊由终末宿主排出，大小为（10.6-12.4）×（10.6-12.0） µm[2]。
图2 犬新孢子虫形态结构[5]
A：速殖子（Giemsa染色），B：先天性感染小牛脊髓神经元内组织包囊的组织学切片（苏木精和伊红染色），厚厚的囊壁（对立的箭头）包围着细长的缓殖子（空心三角形）C：未孢子化的卵囊，D：孢子状卵囊
1.1.3生化特征
犬新孢子虫卵囊的活力仅在100℃环境中持续1分钟或室温下被10%的次氯酸钠处理1小时作用下会被完全破坏，而在-20℃至4℃下持续6小时、60℃持续1分钟、70%乙醇、甲醛、碘伏及氨水等均无法有效灭活，其强抗性源于卵囊壁的致密蛋白质基质对化学渗透的天然屏障作用[5]。
1.2分布、传播与致病性
1.2.1分布与传播
新孢子虫病呈世界性分布，其传播方式分为水平传播和垂直传播两种。
水平传播是指动物摄入速殖子或携带组织包囊的组织或被孢子卵囊污染的食物或饮水而感染犬新孢子虫。
垂直传播是妊娠期间速殖子从受感染的母体经过胎盘传播到胎儿[1]。
1.2.2致病性
犬新孢子虫病的发病机理取决于速殖子在细胞内穿梭和繁殖的能力与宿主阻止其繁殖的能力之间的平衡。与其他种属不同的地方在于：犬新孢子虫可以识别一个或者多个宿主细胞表面的受体，这些受体主要负责细胞入侵的过程。
细胞入侵是犬新孢子虫病发病机理中极为关键的一个因素，该过程有两个不同的步骤：黏附于宿主细胞表面和侵入细胞内。黏附于宿主细胞表面是初始步骤，是由低亲和力的接触所介导的，从而诱导微囊分泌了微丝蛋白。犬新孢子虫的外膜通过上述方式与宿主细胞的质膜发生特异性的接触，并进行重新定位，随后以向前推进的方式进入细胞质，使其被寄生虫空泡（PV）所包裹。细胞入侵这个过程所需要的能量仅来源于犬新孢子虫代谢所产生的能量。目前，从犬新孢子虫中发现了十多种分泌蛋白和两种主要的表面抗原，它们与细胞入侵和PV的形成有关。
感染犬新孢子虫后，宿主的免疫应答之一是CD8+ T细胞反应。研究证实，在犬新孢子虫病进程中，产生IFN-γ是CD8+ T细胞发挥宿主保护作用的主要机制[6]。
感染犬新孢子虫的宿主动物在临床上主要表现为繁殖障碍，如出现流产、死胎、畸形胎、胎儿发育不良等症状，特别是肉牛或奶牛。终末宿主犬科类动物在感染犬新孢子虫后也会出现严重的临床现象，多见于新生幼犬，且以神经症状和后肢麻痹为主，严重者还将伴随着皮肤病、肌肉炎等症状，症状越严重越明显的地方，其寄生在该部位的犬新孢子虫越多。然而，与受其危害最为严重的牛和表现出明显临床症状的犬科动物相比，禽类及多数野生动物却没有明显的临床症状[7]。
1.3检测方法
（1）病原学检查：采用染色镜检的方法，一般采用动物的脑、心和肝等制作组织切片，镜检观察有无犬新孢子虫的速殖子或组织包囊。病原学诊断是最准确可靠的一种方法，但比较耗时也较难将其与弓形虫进行鉴别诊断，还需借助其他方法综合诊断[8]。
（2）分子生物学方法：Loschenberger等人提出一种间接原位PCR法检测犬新孢子虫，结合PCR高灵敏度与免疫组化原位显示优势，通过PRINS反应掺入DIG-11-dUTP，用抗DIG-FITC抗体可视化产物。针对Nc5区域设计引物，详细序列见表1，PCR经35个循环，PRINS为单循环，在感染细胞和组织中获清晰信号，与弓形虫无交叉反应[9]。
表1 犬新孢子虫原位(in situ)PCR检测的引物序列[9]
| 引物名称 | 序列 |
| 外引物1（Np6） | 5′-ccccaaaccccaaaccccGTGCGTTCCAATCCTGTAA-3′ |
| 外引物2（Np21） | 5′-ggggtttggggtttggggCAGTCAACCTACGTCTTCT-3′ |
| 内引物1 | 5′-CGAGGGAGTTGGTAGCGGTGAGA-3′ |
| 内引物2 | 5′-CCTCGTCCGCTTGCTCCCTATG-3′ |
1.4典型案例
Dubeya等人对多种海洋哺乳动物进行血清学检测，发现海獭、海象、海豚等动物体内存在犬新孢子虫抗体。这表明这些海洋哺乳动物曾暴露于犬新孢子虫。海洋哺乳动物生活在海洋环境中，水是它们生存的重要介质，其感染犬新孢子虫很可能与水有关[10]。
1.5防治对策
应保持严格的生物安全以防止疾病进入。此外，应尽量减少水平传播的风险因素，禁止犬只进入饲料储存区、喂食槽和水域，在所有产犊和流产后，小心及时地处理胎盘和胎儿，不要给农场狗喂生牛肉，开展监测计划，检查所有流产母体血清，以监测畜群疾病状况等[11]。
参考文献
[1] 秦建华, 张龙现. 动物寄生虫病学. 北京: 中国农业大学出版社, 2013.
[2] Dubey JP. Review of Neospora caninum and neosporosis in animals. The Korean Journal of Parasitology, 2003, 41: 1-16.
[3] 陈谊, 缪德年, 李春华. 猪病原感染与感染症. 上海: 上海科学技术出版社, 2022.
[4] Dubey JP, Schares G, Ortega-Mora LM. Epidemiology and control of neosporosis and Neospora caninum. Clinical Microbiology Reviews, 2007, 20: 323-367.
[5] Neto AFA, Bandini LA, Nishi SM et al. Viability of sporulated oocysts of Neospora caninum after exposure to different physical and chemical treatments. The Journal of Parasitology, 2011, 97: 135-139.
[6] Alexandra Correia, Pedro Ferreirinha, Sofia Botelho et al. Predominant role of interferon-γ in the host protective effect of CD8+ T cells against Neospora caninum infection. Scientific Reports, 2015, 1: 1-14.
[7] 刘梦婷. 湖南省益阳地区野鸟弓形虫和犬新孢子虫感染调查及弓形虫基因型研究. 湖南农业大学, 2019.
[8] 郑和良. 湖南省肉牛弓形虫和犬新孢子虫感染现状及弓形虫基因型分布研究. 湖南农业大学, 2021.
[9] Loschenberger K, Szolgyenyi W, Pesch ke R et al. Detection of the protozoan Neospora caninum using in situ polymerase chain re-action. Biotech Histochem, 2004, 79: 101-105.
[10] Dubey JP, Zarnke R, Thomas NJ et al. Toxoplasma gondii, Neospora caninum, Sarcocystis neurona, and Sarcocystis canis – like infections in marine mammals. Veterinary Parasitology, 2003, 116: 275-296.
[11] Merck Veterinary Manual. https://www.merckvetmanual.com/reproductive-system/neosporosis-in-cattle/neosporosis-in-cattle?query=Neospora%20caninum.