艰难梭菌（Clostridioides difficile）
物种名：艰难梭菌
拉丁学名：Clostridioides difficile
分类学地位：细菌界Bacteria；厚壁菌门Bacillota；
梭菌纲Clostridia；消化链球菌目Eubacteriales；
消化链球菌科Peptostreptococcaceae；梭菌属 Clostridium；
艰难梭菌（Clostridium difficile）隶属于梭菌属。对氧极为敏感，分离培养较困难，故命名为艰难梭菌。它是一种专性厌氧、有芽孢、产毒素的革兰阳性粗大杆菌，其芽孢位于次极端，可在外环境存活数月。艰难梭菌是人类肠道正常菌群成员，但在不规范使用抗生素时，可能导致肠道菌群失调，引发抗生素相关性腹泻和伪膜性肠炎等疾病[1]。
1.1生物学特性
1.1.1培养特征
艰难梭菌为严格厌氧菌，常在厌氧血琼脂平板或选择性培养基上进行培养。于35-37℃厌氧培养48 h后，可形成直径约3-5 mm、圆形或类圆形、灰白色至淡黄色、表面粗糙、边缘不整齐、一般不溶血的菌落[2]。在环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂培养基（CCFA或CCFA改良培养基）上，菌落多呈黄色或黄白色，部分菌株在紫外线照射下可见黄绿色荧光[3]，这些培养学特征常作为实验室初步识别的重要依据（图1）。
图1 艰难梭菌在CCFA平板上的培养结果[3]
1.1.2形态学特征
艰难梭菌为革兰阳性粗大杆菌，多单个、成对或短链排列，细胞形态可略呈多形性[4]。菌体可形成芽孢，芽孢多为椭圆形，位于菌体次极端或近端部，可使菌体局部膨大，呈“鼓槌样”外观，这是其较有代表性的形态学特征之一[5]。多数菌株具周生鞭毛，具有一定运动性。其芽孢对干燥、热、酸及多种消毒条件均具有较强抵抗力，是该菌在医院环境中长期存在和传播的重要基础。扫描电镜下，艰难梭菌及其芽孢可呈现不同表面结构形态（图2、图3）。
图2 来自各种艰难梭菌菌株的孢子薄片的显微照片[2]
图3 艰难梭菌彩色增强扫描电子显微照片[6]
1.1.3生化特征
艰难梭菌催化酶和氧化酶试验通常为阴性，而L-proline aminopeptidase（PRO 酶）活性多为阳性，可用于实验室快速筛查。该菌能够发酵葡萄糖和果糖，但通常不发酵乳糖、蔗糖和麦芽糖。部分菌株可通过酪氨酸代谢生成对甲酚（p-cresol），该代谢产物具有特征性气味，并可对部分肠道菌产生抑制作用，是艰难梭菌较具代表性的代谢特征之一。此外，吲哚、H₂S、脂酶及卵磷脂酶试验多为阴性，部分菌株可出现明胶液化阳性[7, 9]。
1.1.4分子生物学特征
艰难梭菌毒素基因的表达受致病性基因座（PaLoc）内及基因座外多种调控因子的分子调控。PaLoc包含毒力编码基因tcdA、tcdB以及调控基因tcdR、tcdC和tcdE，其中tcdR对毒素基因表达起正调控作用，tcdC起负调控作用；tcdC在指数期高表达，通过干扰TcdR与RNA聚合酶的识别抑制毒素生成。基因座外的spo0A、codY等则通过抑制tcdR表达间接影响毒素产生。流行RT027型菌株常见tcdC缺失突变，导致毒素高水平表达[10]。
1.2分布、传播与致病性
1.2.1分布与传播
艰难梭菌广泛存在于环境及人和动物的肠道中。艰难梭菌感染是抗生素相关性腹泻和医疗机构相关性腹泻的主要病原，被美国疾病预防控制中心列为抗生素相关的紧迫公共卫生威胁之一。健康人群也可携带该菌，无症状携带在婴幼儿中尤为常见，2岁以上儿童带菌率约为3%，健康成人中带菌率约为1.9%-15.4%。艰难梭菌主要通过粪-口途径传播，即摄入被艰难梭菌芽孢污染的食物或水，或接触被污染的表面后再接触口部。此外，该菌还可通过医疗设备、手术器械、衣物和床单等物品间接传播[11]。
1.2.2致病性
艰难梭菌的主要致病因子是毒素A（TcdA）和毒素B（TcdB），二者通过受体结合域识别并结合宿主肠上皮细胞表面受体，经内吞进入细胞后由半胱氨酸蛋白酶结构域自体催化切割，将葡萄糖基转移酶结构域释放至胞浆；该结构域可糖基化失活Rho家族小GTP酶，导致细胞骨架解聚、紧密连接破坏、细胞坏死及炎症反应，最终引起腹泻和伪膜性结肠炎[10]。
1.3检测方法
（1）谷氨酸脱氢酶初筛联合毒素酶联免疫分析：采用两步EIA法，先检测粪便GDH，阳性样本再检测毒素A/B。GDH敏感性>95%、特异性>90%；毒素EIA特异性>90%，敏感性仅70%~90%。判读标准：GDH阳性且毒素阳性可确诊CDI；GDH阳性而毒素阴性需NAAT确认；GDH阴性可排除CDI。该法可区分定植与感染，但毒素EIA易假阴性，且GDH阳性而毒素阴性时需额外确认，流程较复杂[12]。
（2）实时荧光定量PCR检测：实时荧光定量PCR作为核酸扩增技术（NAAT）的代表性方法，已被IDSA/SHEA2017指南确立为艰难梭菌感染（CDI）诊断的首选单一检测方法。该方法通过特异性引物探针系统靶向检测艰难梭菌毒素B基因（tcdB），其核心原理是利用热稳定DNA聚合酶在体外对tcdB基因特定区域进行指数级扩增，并通过荧光标记探针实时监测扩增产物生成。该方法所用标准引物及探针序列见表1[13]。
表1 艰难梭菌RT-PCR引物序列[13]
| 名称 | 序列 |
| tcdB-F | 5′-TACAAACAGGTGTATTTAGTACAGAAGATGGA-3′ |
| tcdB-R | 5′-CACCTATTTGATTTAGMCCTTTAAAAGC-3′ |
| tcdB-P | FAM-TTTKCCAGTAAAATCAATTGCTTC-TAMRA |
标准反应条件为：采用QIAamp DNA stool minikit进行粪便样本DNA提取；实时PCR反应体系包含500nM正向/反向引物、200nM探针、2mM MgCl₂、dNTPs及热启动TaqDNA聚合酶；热循环参数为95℃预变性10分钟，随后进行45个循环（95℃变性15秒，60℃退火/延伸60秒）；整个检测过程控制在2小时内完成，检测限可达10-100基因组拷贝/mL。该方法具有卓越的诊断性能（敏感性>95%，特异性>95%），但需注意其无法区分定植与感染状态，应在临床评估为有临床意义的腹泻患者中应用[12]。
1.4典型案例
2011年加拿大安大略省尼加拉郡地区由于水源被污染而爆发梭状芽孢杆菌疫情，造成16人死亡。爆发疫情的3家医院分别为大尼加拉总医院（Greater Niagara General Hospital），4名病人死亡；圣凯瑟琳总医院（St. Catharines GeneralHospital），10人死亡；威兰医院（Welland Hospital），2人死亡[14]。
1.5防治对策
（1）抗生素使用：对于因使用抗生素而引发的艰难梭菌感染，应合理选择和使用抗生素，避免长期使用或滥用，从而维护肠道菌群的平衡。
（2）饮食调整：注意饮食卫生，避免食用不洁食品。同时，可适当增加膳食纤维摄入，保持大便通畅，有助于预防艰难梭菌感染。
（3）增强免疫力：保持身体健康，提高免疫力，有助于预防艰难梭菌感染。适当锻炼、保持良好的作息习惯、合理饮食等都有助于增强免疫力。
（4）预防医院感染：对于住院患者，医院应加强感染控制措施，严格执行消毒和清洁程序，以防止艰难梭菌在医院内的传播。
（5）个体防护：注意个人卫生，勤洗手，保持清洁。避免与感染艰难梭菌的人接触，特别是伤口、呼吸道和消化道等部位。
参考文献
[1] Edwards AN, Suárez JM, McBride SM. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of Visualized Experiments, 2013: 50787.
[2] Pizarro-Guajardo M, Calderón-Romero P, Romero-Rodríguez A et al. Characterization of exosporium layer variability of Clostridioides difficile spores in the epidemically relevant strain R20291. Frontiers in Microbiology, 2020, 11.
[3] Public Health Image Library (PHIL). https://wwwn.cdc.gov/phil/Details.aspx?pid=16787
[4] Imwattana K, Shivaperumal N, Leepattarakit T et al. The brief case: a white-colony-producing Clostridioides difficile ribotype 020 strain. Journal of Clinical Microbiology, 2023, 61: e00893-22.
[5] Paredes-Sabja D, Shen A, Sorg JA. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends in Microbiology, 2014, 22: 406-416.
[6] Public Health Image Library (PHIL). https://wwwn.cdc.gov/phil/Details.aspx?pid=9999
[7] Martínez-Meléndez A, Camacho-Ortiz A, Morfin-Otero R et al. Current knowledge on the laboratory diagnosis of Clostridium difficile infection. World Journal of Gastroenterology, 2017, 23: 1552-1567.
[8] Chen R, Feng Y, Wang X et al. Whole genome sequences of three clade 3 Clostridium difficile strains carrying binary toxin genes in China. Scientific Reports, 2017, 7: 43555.
[9] Ramírez-Vargas G, Rodríguez C. Putative conjugative plasmids with tcdB and cdtAB genes in Clostridioides difficile. Emerging Infectious Diseases, 2020, 26: 2287-2290.
[10] 赵敏, 欧阳紫柔, 赵建宏. 艰难拟梭菌毒素致病机制及毒素基因调控的研究进展. 微生物学报, 2023, 63: 2935-2947.
[11] 吴媛, 李文革, 贾筱溪 等. 我国艰难梭菌流行特征和研究进展. 疾病监测, 2021, 36: 319-323.
[12] Viprey VF, Clark E, Davies KA. Diagnosis of Clostridioides difficile infection and impact of testing. Journal of Medical Microbiology, 2024, 73: 001939.
[13] Hara T, Suzuki H, Oyanagi T et al. Clinical evaluation of a non-purified direct molecular assay for the detection of Clostridioides difficile toxin genes in stool specimens. PLoS One, 2020, 15: e0234119.
[14] Niagara Health. https://www.niagarahealth.on.ca/site/news/2011/06/12/update-on-c-difficile-outbreak-at-st-catharines-general.