土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）
物种名：土拉弗朗西斯菌
拉丁学名：Francisella tularensis
分类学地位：细菌界Bacteria；假单胞菌门Pseudomonadota；
γ-变形菌纲Gammaproteobacteria；硫发菌目Thiotrichales；
弗朗西斯菌科Francisellaceae；弗朗西斯菌属Francisella
土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）是引起人和动物土拉菌病的病原体，可通过空气、尘埃和水传播，或污染环境，并且该菌在环境中具有较强的抵抗力，可在自然环境中存活数周。
1.1生物学特性
1.1.1培养特征
土拉弗朗西斯菌对培养基有特殊要求，在普通琼脂和肉汤培养基中均不生长，只能在含有丰富营养物质的培养基中才能生长，最适生长温度为37℃左右，20℃以下停止生长，最适pH 7.0-7.2。常用培养基有凝固卵黄培养基（图1A）、胱氨酸血琼脂培养基（图1B）等。毒力菌株的菌落光滑，白色，圆形，边缘整齐，表面平滑凸起，透光观察呈露滴状，直径1-3 mm，不溶血，但菌落周围形成绿色；无毒菌株菌落为粗糙型绿青色，稍扁平[1]。
图1 土拉弗朗西斯菌在培养基上的生长情况
A：凝固卵黄培养基[2]，B：胱氨酸血琼脂培养基[3]
1.1.2形态学特征
本菌为专性需氧菌，革兰氏染色阴性，是一种多形态的细小状细菌，在患病动物的血液中近似球形；在培养物中呈小球状、杆状、精虫状等，一般无杆状，大小为（0.2-1.0） μm × （1-3） μm。无鞭毛，不能运动，不产生芽孢，在动物体内可形成荚膜。菌体涂片着色不良，经3%盐酸酒精固定标本，用亚甲蓝染色呈两极着染（图2A）；碳酸复红染色效果较好，常呈两极浓染，动物组织涂片可见菌体周围有狭小荚膜（图2B）[1]。
图2 土拉弗朗西斯菌亚甲蓝染色[4]（A）和碳酸复红染色[5]（B）照片
1.1.3生化特征
土拉弗朗西斯菌是革兰氏阴性、专性需氧的球杆菌，无鞭毛、不产芽孢但可产生荚膜，其生化特征包括能发酵葡萄糖、果糖等多种糖类。该菌在外界环境中抵抗力较强，可在低温下的动物尸体、土壤和水中存活数周，主要通过蜱、蚊、鹿蝇等节肢动物叮咬传播，也可经皮肤伤口、呼吸道或消化道感染[6]。
1.1.4分子生物学特征
土拉弗朗西斯菌的基因组为环状DNA，大小约1.89 Mb，G+C含量仅32.3%，编码约1600个蛋白，包含10个rRNA和38个tRNA基因。其基因组的一个显著特征是超过10%的编码序列为假基因，并含有大量插入序列，甚至包括在细菌中罕见的IS630 Tc-1 mariner家族转座子，表明该菌正经历基因组衰变。此外，基因组中以两个拷贝形式存在弗朗西斯菌毒力岛（FPI），且大量代谢通路不完整，与其专性胞内寄生的生活方式相适应[7]。
1.2分布、传播与致病性
1.2.1分布与传播
土拉弗朗西斯菌可通过直接接触传播、食物饮水传播、空气传播和虫媒叮咬传播，经皮肤黏膜、消化道和呼吸道进入机体使人和动物感染发病[6]。土拉弗朗西斯菌的传播媒介为吸血的节肢动物（包括蜱、螨、蚊、蝇、虱等）；土拉菌病出现季节性发病高峰往往与媒介昆虫的活动有关，尤其是以吸食血液为生的蜱是最主要的传播媒介。
1.2.2致病性
土拉弗朗西斯菌强毒株含有表面（Vi）抗原和菌体（O）抗原两种抗原，Vi抗原由类脂-蛋白-多糖组成，O抗原由蛋白-多糖-核蛋白组成，无Vi物质的菌株无毒力。土拉弗朗西斯菌Vi抗原和O抗原成分均为迟发性变态反应原，均可引起感染机体的迟发变态反应，但Vi抗原的抗原性比O抗原的抗原性强许多倍。Vi抗原和内毒素是已知的土拉弗朗西斯菌致病因子[6]。
1.3检测方法
（1）传统方法：取有病变的淋巴结、肝、脾、肾和肺脏等组织器官作为试验材料，对其进行染色涂片和细菌培养，如用亚甲蓝染色、凝固卵黄培养基、胱氨酸血琼脂培养基培养，观察细菌形态、染色、菌落形态等结果对其进行鉴定。
（2）免疫学方法：主要有凝集试验、血细胞凝集试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光染色技术、免疫胶体金技术和上转发光技术等。土拉弗朗西斯菌和布氏杆菌有部分共同抗原，免疫学检测可出现交叉反应，使用土拉弗朗西斯菌的单克隆抗体或将待检血清标本先用布氏杆菌吸收，可避免或降低交叉反应[1]。
（3）分子生物学方法：Buse等人[8]采用培养结合实时荧光PCR法检测环境基质中活土拉弗朗西斯菌，以BVFH为增菌培养基，通过ΔCT≥6判定活菌增殖。针对fopA、pdpD、ISFtu2基因（表1）设计TaqMan探针引物，灵敏度达10 CE/mL。该方法24-48小时可检出低至1 CFU/mL活菌，耐受灭活菌、腐殖酸、试验粉尘等干扰，在饮用水中检测效果稳定，井水基质中检测效果存在菌株差异，适用于流行病学调查与消杀验证。
表1 土拉弗朗西斯菌引物与探针序列[8]
|
基因 |
名称 |
序列（5′→3′） |
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fopA |
上游引物 |
AACAATGGCACCTAGTAATATTTCTGG |
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下游引物 |
CCACCAAAGAACCATGTTAAACC |
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探针 |
FAM-TGGCAGAGCGGGTACTAACATGATTGGT-BHQ1 |
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pdpD |
上游引物 |
GAGACATCAATTAAAAGAAGCAATACCTT |
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下游引物 |
CCAAGAGTACTATTTCCGGTTGGT |
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探针 |
FAM-AAAATTCTGCTCAGCAGGATTTTGATTTGGTT-BHQ1 |
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ISFtu2 |
上游引物 |
CTTGTACTTTTATTTGGCTACTGAGAAACT |
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下游引物 |
CTTGCTTGGTTTGTAAATATAGTGGAA |
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探针 |
FAM-ACCTAGTTCAACCTCAAGACTTTTAGTAATGGGAATGTCA-BHQ1 |
1.4典型案例
2016-2018年，伊朗西北部Youzband村因饮用水源受土拉弗朗西斯菌污染（村民偏好饮用泉水且氯化消毒不足），引发13人口咽型兔热病暴发。检测采用实时PCR（靶向ISFtu2和fopA基因）、试管凝集试验和ELISA，从1份泉水及1只啮齿动物中检出病原；经对患者行多西环素治疗、储水罐清淤氯化及健康教育后疫情得到控制，2年内无新发病例[9]。
1.5防治对策
加强动物检疫和食品饮水卫生管理，避免直接接触感染发病动物及其污染物，避免摄入染疫动物的肉及污染的食物、饮水等；加强个人防护，防止媒介昆虫叮咬，避免吸入含有土拉弗朗西斯菌的气溶胶或尘埃。
参考文献
[1] 文心田, 于恩庶, 徐建国 等. 当代世界人兽共患病学. 成都: 四川科学技术出版社, 2011.
[2] Public Health Image Library (PHIL). https://phil.cdc.gov/Details.aspx?pid=1913.
[3] Public Health Image Library (PHIL). https://phil.cdc.gov/Details.aspx?pid=12509.
[4] Public Health Image Library (PHIL). https://phil.cdc.gov/Details.aspx?pid=2985.
[5] Public Health Image Library (PHIL). https://phil.cdc.gov/Details.aspx?pid=2658.
[6] 维基百科. https://zh.wikipedia.org/wiki/%E5%9C%9F%E6%8B%89%E5%BC%97%E6%9C%97%E8%A5%BF%E6%96%AF%E8%8F%8C#1.
[7] Larsson P, Oyston PC, Chain P, et al. The complete genome sequence of Francisella tularensis, the causative agent of tularemia. Nature Genetics. 2005, 37(2): 153-159.
[8] Buse HY, Morris BJ, Rice EW. Early detection of viable Francisella tularensis in environmental matrices by culture-based PCR. BMC Microbiology, 2020, 20: 66.
[9] Esmaeili S, Rohani M, Ghasemi A et al. Francisella tularensis human infections in a village of northwest Iran. BMC Infectious Diseases, 2021, 21: 310.