结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）
物种名：结核分枝杆菌
拉丁学名：Mycobacterium tuberculosis
分类学地位：细菌界Bacteria；放线菌门Actinomycetota；
放线菌纲Actinomycetes；分枝杆菌目Mycobacteriales；
分枝杆菌科Mycobacteriaceae；分枝杆菌属Mycobacterium
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）俗称结核杆菌，是结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺部感染最多见，称为肺结核。结核病呈世界性分布，是危害全球尤其是发展中国家危害最为严重的慢性传染病之一。
1.1生物学特性
1.1.1培养特征
本菌专性需氧，营养要求高，常需要含有蛋黄、马铃薯、甘油和天冬酰胺的罗氏（Lowenstein-Jensen, L-J）培养基才能生长（图1A）。最适的生长温度为37℃，最适的pH为6.5-6.8。该菌生长缓慢，18-24小时繁殖一代，故接种后的2-4周才能出现肉眼可见的菌落。在琼脂平板上菌落干燥呈颗粒状、结节状或菜花状，乳白或米黄色，不透明（图1B）。在液体培养基中呈粗糙皱纹状生长，加入水溶性脂肪酸可降低结核分枝杆菌的表面疏水性，个体则呈均匀分散生长，有利于进行药物敏感试验和细菌的初次分离培养[1]。
图1 结核分枝杆菌菌落形态
A：L-J培养基[2]，B：琼脂平板[3]
1.1.2形态学特征
结核分枝杆菌菌体细长略弯曲，菌体大小为（1.0-4.0） μm× 0.4 μm，单个或呈分枝状排列，无鞭毛，无芽孢（图2A）。但在陈旧病灶和培养物中，形态常不典型，呈颗粒状、短棒状、串珠状、长丝状、索状等。用革兰染色法不易着色，一般用齐-尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法染色，本菌呈红色，其他细菌和背景为蓝色（图2B）[1]。
图2 结核分枝杆菌纤维照片
A：扫描电镜照片[4]，B：齐-尼抗酸染色照片[5]
1.1.3生化特征
结核分枝杆菌不发酵糖类。与牛分枝杆菌的区别在于结核分枝杆菌可合成烟酸并能还原硝酸盐，而牛分枝杆菌则不能。热触酶试验可区别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，结核分枝杆菌大多数触酶试验阳性，而热触酶试验阴性；非结核分枝杆菌则大多数两种试验均阳性[1]。
1.2分布、传播与致病性
1.2.1分布与传播
结核分枝杆菌常存在于受污染的水环境中，免疫力低下或者皮肤有破损的人接触有结核分枝杆菌的污水可能导致肺结核的发生。
1.2.2致病性
结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道及破损的皮肤等多途径感染人体，引起多种组织器官的感染以肺部感染最常见。感染该菌可引起淋巴管炎和肺部淋巴结肿大，形成纤维化或钙化。少数免疫力低下患者，可发展成活动性肺结核，或由于结核分枝杆菌的扩散而引起粟粒性结核，侵犯各处淋巴结、骨、关节、肾及脑膜等部位[6]。
结核分枝杆菌不产生外毒素、内毒素和侵袭性酶类。结核分枝杆菌具有能在肺泡巨噬细胞中生长的能力，是该细菌毒力的主要决定因素，除此以外，也与该菌能在细胞内增殖引起炎症反应、机体对菌体成分产生的免疫损伤以及代谢物质的毒性有关。结核分枝杆菌具有的主要致病物质如下[2]：
（1）脂质：本菌细胞壁所含的脂质占菌体干重的20%-40%，约占细胞壁干重的60%，主要有磷脂、脂肪酸和蜡质D，它们大多与蛋白质或多糖结合以复合物形式存在。
（2）蛋白质：结核分枝杆菌的结核菌素（tubereulin）能与蜡质D结合，而使机体发生迟发型超敏反应，引起组织坏死和全身中毒症状，并参与结核结节的形成。
（3）多糖：主要有阿拉伯糖、甘露醇、半乳糖等，常与脂质结合，具有介导速发型超敏反应和非特异性增强机体免疫功能的作用。
（4）荚膜：主要成分为多糖、含脂质和蛋白质。其对结核分枝杆菌有保护作用：①荚膜能与吞噬细胞表面的补体受体3（CR3）结合，有助于细菌在宿主细胞上的黏附与侵入；②荚膜中有多种酶能降解宿主组织中的大分子物质，提供人侵的细菌繁殖所需的营养；③荚膜能阻止有害物质进入结核分枝杆菌；④结核分枝杆菌人侵后荚膜还可抑制吞体与溶酶体的融合。
1.3检测方法
（1）传统方法：采用齐-尼抗酸染色法对结核分枝杆菌进行染色鉴定。使用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5 min，待标本冷却后用水冲洗；3%盐酸酒精脱色30 s-60 s；用水冲洗；用碱性美兰溶液复染1 min，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察[7]。
（2）免疫磁珠（Immunomagnetic beads, IMB）荧光染色法：吴殿水等建立了采用IMB检测临床痰液标本结核分枝杆菌的方法，发现最低结核分枝杆菌检测量是30 CFU/mL，在标本含菌量≥30 CFU/mL时，该方法学的敏感度为100%；而在10 CFU/mL时则降到56%，该方法检测的特异度为100%。该方法的阳性检出率大大高于传统的染色方法[8]。
（3）Xpert MTB/RIF检测：取胃液/痰液总量2 mL置于无菌离心管内，添加NaOH溶液予以中和，直至NaOH最终浓度为1.50%。充分振荡10-l5 s，随后于室温下静置15 min，每间隔5 min再次充分振荡，使其混合均匀。置于离心机内，以4000×g离心15 min，弃去上层清液，于离心管内添加总量2 mL氢氧化钠溶液处理的胃液，将沉淀混匀后加入检测盒中上机检测。当MTB DNA呈阳性时（DNA≥100 拷贝/mL），按照MTB的Ct值（100 拷贝/mL）间接反映检测样本的MTB菌载量[9]。
（4）分子检测方法：先合成靶向结核分枝杆菌重复DNA序列的特异性引物，利用Taq聚合酶及配套试剂配制含缓冲液、核苷酸、1 μM各引物的反应体系并分45 μL aliquots分装，加入5 μL待检分枝杆菌DNA样本后用矿物油封层，同时设置无DNA的阴性对照管；随后用PCR仪进行扩增，先94℃预变性5 min，再进行25个扩增循环，每个循环依次为94℃变性2 min、68℃退火2 min、72℃延伸2 min且每次延伸时间增加5 s；扩增完成后，将产物进行0.8%琼脂糖凝胶或12%丙烯酰胺凝胶电泳，经溴化乙锭染色后在302 nm紫外透射仪下拍照观察检测扩增产物，还可通过SalI内切酶消化产物并电泳分析，进一步验证扩增产物的特异性。
表1 PCR引物序列[4]
| 名称 | 序列（5’→3’） |
| 正向引物 | CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG |
| 反向引物 | CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG |
1.4典型案例
南非德班三座接收医院污水、TB/MDR-TB负担较重的污水处理厂中，研究人员通过常规PCR和微滴数字PCR技术检测发现，结核分枝杆菌在未处理污水中检出率达75-100%，经处理后其检出率和浓度虽有下降但仍有残留，且各污水厂的处理工艺对该菌的对数去除率无统计学差异，其在污水中的持续检出也反映了当地社区结核分枝杆菌的流行传播现状[11]。
1.5防治对策
接种卡介苗（BCG）被认为氏目前最好能预防结核分枝杆菌感染导致人患肺结核的手段。目前结核病治疗主要以药物化疗为主，利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素，吡嗪酰胺等为主要抗结核药物。
参考文献
[1] 张柯媛, 李新伟, 王晓静. 病原生物与免疫学. 天津: 天津科学技术出版社, 2022.
[2] Parija SC. Textbook of Microbiology and Immunology. Springer, 2023.
[3] Public Health Image Library (PHIL). https://phil.cdc.gov/Details.aspx?pid=4428.
[4] Public Health Image Library (PHIL). https://phil.cdc.gov/Details.aspx?pid=18138.
[5] Public Health Image Library (PHIL). https://phil.cdc.gov/Details.aspx?pid=2127.
[6] Koch A, Mizrahi V. Mycobacterium tuberculosis. Trends Microbiol, 2018, 26: 555-556.
[7] 胡桂, 刘成侠. 病原微生物学与免疫学实验技术. 北京: 中国医药科技出版社, 2015.
[8] 吴殿水, 王新芳, 朱妍妍 等. 免疫磁珠荧光染色法在痰液结核分枝杆菌检测中的应用. 现代检验医学杂志, 2023, 38: 96-101.
[9] 阮树松, 欧维正, 祁仁杰. 基于利福平耐药结核分枝杆菌半巢式实时荧光定量PCR技术检测胃液结核分枝杆菌在儿童肺结核中的诊断价值. 当代医学, 2024, 30: 134-138.
[10] Eisenach KD, Cave MD, Bates JH et al. Polymerase Chain Reaction Amplification of a Repetitive DNA Sequence Specific for Mycobacterium tuberculosis. The Journal of Infectious Diseases, 1990, 161: 977-981.
[11] Mtetwa HN, Amoah ID, Kumari S et al. Molecular surveillance of tuberculosis-causing mycobacteria in wastewater. Heliyon, 2022, 8:e08910.