霍乱弧菌（Vibrio cholerae）

物种名：霍乱弧菌

拉丁学名：Vibrio cholerae

分类学地位：细菌界Bacteria；假单胞菌门Pseudomonadota；

γ-变形菌纲Gamma proteobacteria；弧菌目Vibrionales；

弧菌科Vibrionaceae；弧菌属Vibrio

霍乱弧菌（Vibrio cholerae）是霍乱疾病的病原菌。霍乱具有传染性强、发病急、死亡率高等特点，为我国甲类法定传染病。霍乱弧菌有两种生物型：古典生物型（Classical bio-type）和埃尔托生物型（El-Tor bio-type），古典生物型通常比E1-Tor生物型引起的感染更严重。根据O抗原的不同，可将霍乱弧菌分为200余个血清群，其中O1群和O139群是致病群^[1]。

1.1生物学特性

1.1.1培养特征

霍乱弧菌对营养要求不高，在普通琼脂培养基或蛋白胨水中生长良好，在碱性琼脂平板上经12-18小时培养可形成圆形，透明或半透明的无色，扁平菌落；在TCBS培养基上生长良好，菌落呈黄色，培养基呈暗绿色（图1）。该菌耐碱不耐酸，适合在pH 8.0-9.0的碱性环境中生长，因其他细菌在此环境中不易生长，故常用pH 8.4的碱性蛋白胨作为选择培养基^[2]。

图1 霍乱弧菌在TCBS平板上的生长情况^[3]

1.1.2形态学特征

霍乱弧菌是革兰氏阴性菌，细菌弯曲呈弧形或逗点状，大小为（0.8-3.0） μm×（0.5-1.5） μm，含有用于运动的单极鞭毛，菌体两端钝圆或者稍平，运动极为活泼。霍乱弧菌O1群无荚膜，有普通菌毛和性菌毛，O139群有多糖荚膜，不形成芽胞^[2]。

图2 霍乱弧菌显微照片

A：革兰氏染色照片^[4]，B：扫描电镜照片^[5]

1.1.3生化特征

霍乱弧菌氧化酶试验和明胶试验呈阳性，靛基质试验阳性。对干燥、化学消毒剂等抵抗力弱，煮沸10分钟立即死亡，日光照射下一至数小时死亡，在10 g碳酸钠中5分钟死亡^[6]。O1群霍乱弧菌能发酵蔗糖和甘露糖，不发酵阿拉伯糖。O139霍乱弧菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露糖，产酸不产气，不发酵肌醇和阿拉伯糖。

1.1.4分子生物学特征

霍乱弧菌包含2个染色体，1号染色体约2.0 Mb，2号染色体是一个环形的质粒约1.0 Mb，2个染色体共有3885个开放阅读框（ORF）。1号染色体包含重要细胞功能（如转录和翻译）、与致病性相关的霍乱毒素（Choleratoxin, CTX）、以及与毒性调节相关的关键基因。2号染色体上存在与正常细胞功能和中间代谢途径相关的单拷贝基因，此外，还存在着一个巨大的基因捕获系统，在这个区域内存在霍乱弧菌所有重复序列的拷贝和216个开放阅读框，有耐药性相关基因，DNA代谢酶类编码基因，致病和毒素相关基因三大类已知基因^[7]。

1.2分布、传播与致病性

1.2.1分布与传播

霍乱弧菌的致病性和非致病性菌株均存在于水生环境中，是河口、海水中的正常细菌群^[8]。霍乱是经粪-口感染的肠道传染病，主要经水、食物及生活密切接触传播。当开放性伤口接触到盐水或咸水（淡水和盐水的混合物，通常出现在河流与海洋交汇的地方）时，这种细菌也会引起感染。霍乱疾病全年均能发生，但多发于夏、秋季的6-10月份^[9]。

1.2.2致病性

霍乱弧菌O1血清群和O139血清群是致病性弧菌中适应力最强的细菌，可在淡水和3%的盐水中生存。在河水中最长可存活20天，在冰中可存活4小时，在水果蔬菜中可存活7天左右^[6]。

霍乱的临床表现主要分为潜伏期、泻吐期、脱水期和反应期4个阶段。感染该细菌会导致肠道增加粘液分泌（图3），引起腹泻和呕吐，导致极度脱水，如不及时治疗则会死亡。由于大量水分和电解质丧失而导致严重脱水、代谢性酸中毒、低碱血症和低容量性休克及心律不齐和肾功能衰竭。

21414

图3 霍乱弧菌感染胃肠黏膜病理组织图片^[10]

霍乱弧菌的致病因子主要有CTX基因元件、毒力岛和tox R三种。CTX基因元件以噬菌体形式存在，其中ctx AB基因编码霍乱肠毒素（cholera enterotoxin， CT），该毒素是霍乱弧菌的主要致病因子，由5个B亚基组成，这些B亚基形成一个孔隙，以容纳1个A亚基，其中A亚单位为1个27.2 kD的蛋白质，被剪切为A1和A2两部分，A1为毒素的生物活性部分，而B亚单位是毒素与宿主细胞膜受体结合部分的一种非毒素蛋白。毒力岛（V.cholera pathogenity island, VPI）大小为39.5 kb，主要编码毒素协同调节菌毛（Toxin coregulated pilus, Tcp）和辅助定居因子（Accessory colonization factor, Acf）等毒力因子。tox R为一个32 kDa的跨膜蛋白，主要调控CT和Tcp编码基因的表达^[11]。

目前霍乱弧菌已经表现出对氨基糖苷类、磺胺类药、甲氧苄氨嘧、β-内酰胺类、四环素、季胺类化合物以及汞离子的耐药性，甚至导致对多种抗生素同时耐药的特征。

1.3检测方法

传统方法：可疑样品制备后，接种至碱性蛋白胨水增菌培养，取增菌液划线接种至TCBS选择性培养基培养，挑取典型可疑菌落进行革兰染色，观察结果，并进一步通过生化反应、O1群及O139群霍乱弧菌诊断血清玻片凝集反应完成鉴定^[12]。
免疫学检测方法：主要包括酶联免疫吸附检测技术和快速检测技术（RDT，如胶体金免疫层析试纸条等）。准备Crystal VC试剂盒，将免疫层析试纸条放入装有稀释样本的试管中，确保试纸条上标记有箭头的一端完全浸没在液体中，观察结果：仅出现对照线为阴性，同时出现对照线与O1检测线或O139检测线为阳性^[13]。
分子生物学检测方法：万莹^[14]等以霍乱弧菌种特异性基因ompW和毒力基因ctx、hly为靶基因，分别设计特异性引物及相应的TaqMan探针。在ompW、ctx、hly探针的5’端分别标记CY5、FAM、HEX荧光报告基团，3’端均标记BHQ1荧光淬灭基团。该方法与其他菌株无交叉反应，具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点，是高通量检测致病性霍乱弧菌的有效手段。

表1 荧光定量PCR引物序列

引物	序列
ctx上游引物	5′-GCTGCATTCAAAACATCTGCTT-3′
ctx下游引物	5′-CTCGAACAAACAATATCTCATCA-3′
ctx探针	5′-FAM-TTCCATCGTCCCTTTTCCTGCCCC-BHQ1-3′
ompW上游引物		5′-GCTACCAAGAAGGTGACTTTATTG-3′
ompW下游引物		5′-AACTGCCAACTCACTTTGAGTGTTT-3′
ompW探针	5′-CY5-CGCGGGTATTGCCTCGGTAGTACCT-BHQ1-3′
hly上游引物	5′-GGTTAGCTTTACATGGAATCGTCA-3′
hly下游引物	5′-CTACCGGGTAGGTATTCACCCA-3′
hly探针	5′-HEX-ACGCGACAGCAGAATCGCTACTCAA-BHQ1-3′

1.4典型案例

2016年3月，乌干达东部布兰布利区爆发霍乱疫情，累计报告疑似病例108例，确诊7例，死亡2例。流行病学调查证实，疫情由受霍乱弧菌污染的切普图伊河饮用水引发。病例对照研究显示，饮用未处理河水者患病风险升高7.8倍，7份水样中2份检出致病菌，而机井水未检出污染。当地开放排便、河岸洗衣加剧水体污染，经推广饮水消毒、增设安全水源等措施后，疫情于4月6日得到控制^[15]。

2017年，由于电力短缺，刚果东部北基伍省戈马市饮用水供应中断，居民使用被污染的水后，霍乱疫情迅速爆发。7月11日以来，该国东部已报告3140例霍乱病例，至少117人死亡^[16]。

1.5防治对策

不要吃生的或未煮熟的海鲜产品；确保安全供水，保持环境卫生；加强食品安全的监督和管理；若有伤口，应避免接触盐水、咸水或涉水、钓鱼或清洗海鲜时的海鲜汁液；如果伤口接触到盐水、咸水、生海鲜或生海鲜汁液，应尽快用肥皂和水清洗伤口^[17]。

参考文献

[1] 屠丽红, 张曦, 陈洪友等. 2005-2014年上海市O139群霍乱弧菌的分子特征和耐药性研究. 疾病监测, 2015, 30: 223-227.

[2] 陈殿学. 医学免疫学与病原生物学第2版. 上海: 上海科学技术出版社, 2020.

[3] Public Health Image Library (PHIL). https://phil.cdc.gov/Details.aspx?pid=3906.

[4] Public Health Image Library (PHIL). https://phil.cdc.gov/Details.aspx?pid=5324.

[5] Public Health Image Library (PHIL). https://phil.cdc.gov/Details.aspx?pid=7818.

[6] 孙亮, 陈江, 章荣华. 食源性疾病监测知识. 杭州: 浙江工商大学出版社, 2021.

[7] Trucksis M, Michalski J, Deng YK et al. The Vibrio cholerae genome contains two unique circular chromosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998, 95: 14464-14469.

[8] Faruque SM, Nair GB. Molecular ecology of toxigenic Vibrio cholerae. Microbiology and Immunology, 2002, 46: 59-66.

[9] 阚飙, 詹启敏. 精准预防诊断系列: 传染性疾病与精准预防. 上海: 上海交通大学出版社, 2020.

[10] Public Health Image Library (PHIL). https://phil.cdc.gov/Details.aspx?pid=21414.

[11] 王洪敏, 马文丽, 郑文岭. 霍乱弧菌的致病性与流行性研究进展. 生物化学与生物物理进展, 2003, 30: 38-42.

[12] 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会. 微生物快速测定方法(GB/T 38488-2021). 2021.

[13] Mukherjee, Piyali, Ghosh et al. Evaluation of a Rapid Immunochromatographic Dipstick Kit for Diagnosis of Cholera Emphasizes Its Outbreak Utility. Japanese Journal of Infectious Diseases, 2010, 63: 234-238.

[14] 万莹, 陈永军, 任亚玲等. 霍乱弧菌三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用. 中国兽医科学, 2019, 49: 1143-1151.

[15] Okello PE, Bulage L, Riolexus AA, et al. A cholera outbreak caused by drinking contaminated river water, Bulambuli District, Eastern Uganda, March 2016. BMC Infectious Diseases. 2019, 19: 516.

[16] 央视网. http://m.news.cctv.com/2017/08/13/ARTIuhPMPtpiXTyDe0JVcfNZ170813.shtml.

[17] Centers for Disease Control and Prevention (CDC). https://www.cdc.gov/cholera/non-01-0139-infections.html.