柯萨奇病毒（Coxsackieviruses）
物种名：柯萨奇病毒
拉丁学名：Coxsackieviruses
分类学地位：病毒界Viruses；核糖病毒域Riboviria；正病毒界Orthornavirae；Pisuviricota门Pisuviricota；Pisoniviricetes纲Pisoniviricetes；Picornavirales目Picornavirales；小核糖核酸病毒科Picornaviridae；肠道病毒属Enterovirus
柯萨奇病毒（Coxsackievirus）是一种肠病毒（enterovirus），分为A和B两类，是一类常见的经呼吸道和消化道感染人体的病毒，感染后人会出现发热、打喷嚏、咳嗽等感冒症状。柯萨奇病毒为1948年Gillbert Dalldorf博士和他的同事在寻找治愈脊髓灰质炎疾病的过程中在粪便样品中首次获得，因在纽约柯萨奇小镇发现而得名。同其他类型肠道病毒相同，柯萨奇病毒可通过粪口途径和口口途径传播。其中，接触感染者粪便污染的水、食物及土壤可以导致粪口途径传播。一般情况下，婴幼儿大多隐性感染；而5岁以下，尤其是3岁以下儿童，排毒时间可长达一个月。病毒感染人体后，可引起上呼吸道感染、急性心肌炎等疾病，对婴幼儿的健康造成严重威胁。
1.1生物学特性
1.1.1培养特征
柯萨奇病毒根据感染人类细胞的生物学和免疫学特性被划分为A组和B组，其中B组共有6个血清型（B1-B6）[1]。B组病毒属于肠道病毒属B种，病毒颗粒无包膜，含单链正链RNA，是对婴幼儿危害较大的病原之一。柯萨奇病毒感染宿主细胞常导致细胞变圆、皱缩、脱落等典型细胞病变。为了探索柯萨奇病毒B族1、2、3型（CVB1、CVB2和CVB3）的培养特性，邓自君等人于2024年报道利用人胚肺二倍体细胞KMB17进行适应性培养，通过设置不同感染复数梯度，比较三种血清型的适宜感染条件该研究发现CVB1、CVB2、CVB3均能在KMB17细胞中复制，并产生明显的细胞病变（CPE），为后续多价疫苗制备提供实验基础[2]。
通过对接种病毒后的细胞进行观察，CVB1、2、3型均能在KMB17细胞上进行培养并使细胞产生CPE。CVB1、2、3型感染细胞后造成细胞变圆皱缩脱落（图1）[3]。
柯萨奇病毒B5型是B组的一个血清型，它的研究与人类胰岛β细胞功能异常和糖尿病等疾病相关。Al-Hello等人报道对一株在小鼠胰腺内连续传代15次的柯萨奇病毒B5实验室毒株进行研究，该毒株被命名为CBV-5-MPP。这种传代病毒可以在小鼠中诱发类糖尿病综合征，为进一步研究其与胰岛细胞的相互作用，研究者用CBV-5-MPP感染小鼠胰岛素瘤细胞系MIN‑6[3]。结果显示，该病毒在MIN‑6细胞中需要数日的适应才能产生子代病毒和细胞病变。
CBV5-MPP以5倍的倍数感染MIN-6细胞平行孔。每隔一段时间采集标本，用免疫荧光法对病毒抗原进行染色，跟踪病毒复制的进展。在感染后1天和2天染色的培养物中仅见少量感染细胞。然而，感染3天后，可以看到几个受感染的细胞，这表明已经发生了对病毒复制的适应。再孵育24小时后，MIN-6细胞完全裂解（未示出），并在第6天收获MIN-6细胞适应病毒株[3]。
图1 CVB1-3型在KMB17细胞上培养引起的细胞病变（40×）
A：CVB1在KMB17细胞上引起的CPE，B：CVB2在KMB17细胞上引起的CPE，
C：CVB3在KMB17细胞上引起的CPE，D：KMB17细胞正常对照[2]
1.1.2形态学特征
人胚肺二倍体成纤维细胞系KMB17因无致瘤性、无外源污染且对多种病毒敏感而被广泛用于病毒学研究和疫苗制备，对柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒等具有良好的适应性，是研究柯萨奇病毒B族1、2、3型培养特性的理想底物[4]。采用KMB17株对CVB1、2、3型进行适应性培养，探索应用KMB17细胞培养CVB1-3型病毒的相关参数，取3种血清型CVB病毒收获液于电镜下观察，均可见到典型的病毒颗粒（图2）。柯萨奇病毒颗粒呈典型的无包膜正二十面体对称结构，直径约27–30 nm[2]，由60个原型粒子组成，每个原型粒子含有VP1、VP2、VP3（位于表面）和VP4（位于内侧，常带有肉豆蔻酰基修饰），整体呈pseudo-T=3排列[5]。冷冻电镜与X射线晶体学研究显示，其表面形态具有特征性的”mesa”（位于五重轴顶端）、围绕其形成的”canyon”（峡谷型受体结合槽），以及三重轴处的”三叶螺旋桨”样结构，这些拓扑特征与受体识别密切相关[6,7]。形态学观察常可见完整病毒颗粒与空衣壳两类，前者沉降系数为140–165S，CsCl浮力密度约1.30–1.34 g cm⁻³（重粒子可达1.43 g cm⁻³），后者沉降系数约70–80S。由于无包膜，病毒对醚、氯仿等脂溶剂不敏感，并且多数柯萨奇病毒对酸性环境（约pH 3）仍具稳定性，这与其肠道传播途径相适应[8]。透射电镜下病毒呈致密均一的小圆颗粒，而高分辨率结构揭示其衣壳蛋白的精细构型及与受体结合的界面，这些形态学特征为理解其感染机制与疫苗设计提供了重要依据。
图2 电镜观察柯萨奇病毒颗粒。
A：CVB1型，B：CVB2型，C：CVB3型（20000×）[3]
1.1.3生化特征
柯萨奇病毒对理化条件的耐受性表现为：因无包膜而对醚、氯仿等有机溶剂和常见去污剂相对稳定，但对热、强酸或强碱敏感，不同血清型的热稳定性和酸稳定性存在差异[9]。在受体利用方面，柯萨奇B型病毒主要通过CAR（Coxsackievirus and Adenovirus Receptor）进入宿主细胞，部分株也能结合DAF（CD55）或其他受体。受体结合常伴随衣壳构象改变，形成扩展的中间体（A-particle），使内部蛋白质位置发生改变，从而促进基因组RNA的释放[8, 10, 11]。总体来看，柯萨奇病毒的生化特征主要体现为颗粒无包膜但结构稳定，具有显著的耐受性和敏感性差异，衣壳表面拓扑结构与受体结合密切相关，以及受体结合后通过构象转换实现基因组释放的过程。
在KMB17细胞系中，邓自君等人[2]采用微量细胞病变法比较三种柯萨奇B病毒血清型在不同感染复数（MOI）下的产量。当细胞病变度达到约80%时测定收获液滴度（图3）。一定范围内3种血清型CVB在细胞上培养后收获液的滴度均随MOI值的上升而增加，其中CVB1收获液滴度在MOI值达到0.25时出现平台期，CVB2收获液滴度在MOI值达到0.2时出现平台期，CVB3收获液滴度在MOI值达到0.3时出现平台期。
图3 不同MOI条件下KMB17细胞收获液的CVB1、2、3型病毒滴度
A：KMB17细胞培养CVB1型收获液滴度，B：KMB17细胞培养CVB2型收获液滴度
C：KMB17细胞培养CVB3型收获液滴度
1.1.4分子生物学特征
柯萨奇病毒A6型（CV‑A6）属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属的Enterovirus A物种，与柯萨奇病毒B型同为典型的无包膜正二十面体病毒(图4)。它的颗粒直径约30 nm，由60个原型粒子组成[4]。基因组为单股正链RNA，长度约7.4kb，含5′和3′非翻译区，可直接作为mRNA翻译一条大约2200个氨基酸的多聚蛋白[9, 12]。这一多聚蛋白随即在病毒蛋白酶2A和3C/3CD的作用下切割为三个前体区P1、P2和P3：其中P1区经进一步加工生成四种结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4，它们组成衣壳并参与受体结合及基因组释放；P2和P3区则产生2A、2B、2C、3A、3B（VPg）、3C和3D等非结构蛋白，分别负责宿主翻译抑制、膜重塑、NTP酶活性、复制复合体形成、基因组复制引物、多肽加工及RNA复制等功能。
冷冻电镜研究表明，CV‑A6存在成熟颗粒、解包裹中间体（A‑粒子）和空衣壳三种形态。成熟颗粒含有完整RNA和VP1–VP4，五聚轴处有星形突起并围绕深峡谷；A‑粒子和空衣壳的衣壳稍微扩张，缺失VP4，口袋因子消失。研究者发现，不同株系中A‑粒子比例可能很高，提示其可能是重要的传染粒子。进一步实验还证明，KRM1（Kringle1含蛋白）是CV‑A6的解包裹受体，而肝素硫酸糖胺（HSPG）充当主要附着受体；KRM1与衣壳峡谷结合可诱导成熟粒子向A‑粒子转变，特异性单克隆抗体1F4和3H7则通过阻断该过程发挥中和作用[13]。
综上，CV‑A6的分子生物学特征包括典型的无包膜正二十面体衣壳、约7.4kb的正链RNA基因组及其翻译成单一多肽并分割为结构和非结构蛋白的机制。近年来对其结构、受体识别和抗体中和机制的解析，阐明了该病毒适应宿主的分子基础，也为疫苗和药物开发提供了科学依据。
图4 CV-A6的病毒结构[14]
1.2分布、传播与致病性
1.2.1分布与传播
柯萨奇病毒属于肠道病毒属，目前已分离出多个血清型。近年来Coxsackie A6型(CV‑A6)在全球暴发并迅速取代Enterovirus A71(EV‑A71)和Coxsackie A16型(CV‑A16)成为手足口病的主要病原。CV‑A6感染常呈现”非典型”手足口病表现，如全身水疱及甲床脱落，提示其致病性与其他血清型不同。我国对CV‑A6的分子流行病学研究显示，该病毒自2006年起即在中国各地多次输入传播，并且自2019年起D3亚型成为优势株。2021-2023年河南省实验室确诊的手足口病病例中CV‑A6占22.88%，2022-2023年已成为主要流行株[5]。全球多地报道了CV‑A6相关的手足口病暴发，例如2008年芬兰、2009年新加坡、2010年日本、2011年西班牙以及2011—2012年的泰国等。在我国，手足口病每年常于春夏之交（4月至7月）出现高发期。
病毒通过飞沫和密切接触传播，含病毒的鼻咽分泌物、唾液、肠道排泄物和疱疹液都是传染源。患者或带毒者在疾病早期传染性最强，但康复后仍可在数周内经粪便排毒[15]。接触被污染的玩具、食具、桌面等也可导致间接传播；少数情况下，病毒可通过处理不当的游泳池水或饮用水传播。环境监测显示，肠道病毒在自然水体中广泛存在，多地生活饮用水和自来水检出率高达19%～28%，甚至有研究报告巴基斯坦城市自来水的检出率达到43%，说明水环境可能是柯萨奇病毒传播的重要媒介之一[15]。此外，严重病例还可通过母婴垂直传播。报道显示，当孕妇在围产期出现手足口病症状时，CV‑A6可经胎盘传播给胎儿，新生儿表现为严重呼吸衰竭和肺炎。
1.2.2致病性
柯萨奇病毒通常在咽扁桃体和小肠黏膜上皮细胞内初步复制，随后进入血液造成短暂的病毒血症，病毒可经血行播散至皮肤、黏膜、心肌、脑膜、胰腺等多个器官。大部分感染者症状轻微或无症状，但某些血清型可引发严重疾病。Coxsackie B病毒（CV‑B）是病毒性心肌炎和扩张型心肌病的主要病原之一，约10%–20%的病毒性心肌炎与该病毒相关。部分CV‑B血清型，如CV‑B4，还被认为与儿童1型糖尿病发生相关[16]。CV‑A6感染多表现为发热、手足和口腔水疱，但近年来也出现累及甲床脱落、全身广泛丘疹等重症病例。母婴传播的病例提示病毒可导致新生儿重症肺炎甚至死亡。
2018年《Journal of Virology》报道了Changchun046等多株CV‑A6的毒力比较实验[17]。研究者将新生乳鼠腹腔接种滴度为105.0、104.0、103.0和102.0 CCID50/mL的CC046病毒。高滴度（105.0和104.0 CCID50/mL）感染组在第3天开始出现1级症状，随后症状迅速加重，第6天或第9天达到了5级，并在第4天和第5天开始出现死亡，分别在感染后第10天和第11天造成全部乳鼠死亡。中低滴度（103.0和102.0 CCID50/mL）感染组的症状较轻，死亡率约为50%和28.6%，提示CC046病毒的致病性具有明显的剂量依赖性。
近年来，与EV71或CV-A16无关的HFMD病例也有很多报道，而且由柯萨奇病毒A6型（CV-A6）所引起的手足口病所占的比例越来越高，其引起的临床症状由早期的疱疹性咽峡炎向多部位广泛出疹及伴随脱甲转变[18]。
图5 滴度为105.0~104.0 CCID50/mL的CC046病毒免疫乳鼠
1.3检测方法
（1）免疫学方法：使用一日龄无特异性病原体（SPF）ICR新生乳鼠建立病毒感染的动物模型，以研究CV-A6病毒的致病性及免疫反应。实验中，将购得的乳鼠随机分为五组，实验组分别用三种滴度的四种CV-A6病毒株（CC046、CC097、CC098、CC099）进行颅内注射，每个滴度8-10只乳鼠，对照组则注射DMEM。在接种后的21天内，对所有乳鼠每日监测临床症状及存活率，并通过Reed-Muench方法计算病毒的半数致死剂量。为评估病毒载量，实验取乳鼠各组织和器官，提取RNA并进行反转录生成cDNA，再通过实时定量PCR检测各组织器官中的病毒水平。此外，对乳鼠组织和器官进行标本制作，以开展组织病理学分析，从而观察病毒感染引起的组织损伤和病理变化，为CV-A6病毒感染的病理机制提供实验依据[19]。
（2）分子检测方法：SN/T 5325.6-2020[20]中柯萨奇病毒（CV）的定量检测采用数字PCR（dPCR）技术，其核心原理是通过将含有模板RNA的PCR反应液分割成数万个独立的微反应体系，使每个体系独立进行一步法逆转录-PCR扩增，随后根据泊松分布原理，通过统计阳性微反应体系的比例来计算原始模板的绝对拷贝数，实现无需标准曲线的绝对定量。检测流程首先根据食品基质（贝类、硬质表面、生食蔬菜/软质水果）进行病毒富集，在此过程中会向样品中添加MS2噬菌体作为过程质控（PC）物质以监控整个流程的回收效率。富集后，使用Trizol试剂法提取并纯化病毒RNA。数字PCR扩增采用双重检测模式，其中CV-A6和CV-A10共用一个反应体系，CV-A16和CV-B2共用另一个反应体系。
各型病毒的特异性引物和探针序列在标准中有明确规定：
表1 CV-A6 dPCR引物序列
| 名称 | 序列 |
| 上游引物 | 5′-CAAGCTGCAGAAACGGGAG-3′ |
| 下游引物 | 5′-GCTCCACACTCGCCTCATT-3′ |
| VIC探针 | 5′-VIC-CCGTTTCGATTCATCA-MGB-3′ |
表2 CV- A10 dPCR引物序列
| 名称 | 序列 |
| 上游引物 | 5′-CTCGTCCGTACATGCTGCA-3′ |
| 下游引物 | 5′-TGCAGGAGGGTCAGTGAGTT-3′ |
| FAM探针 | 5′-FAM-TT+T+CAATGGCAAA+C+AGCAAC-BHQ1-3′ |
CV-A16和CV-B2的引物为简并引物，分别针对其保守序列设计。
扩增反应体系为20 μL，包含8 μL一步法数字RT-PCR预混液、各1.5 μL的上下游引物、各0.5 μL的探针、2 μL的RNA模板及无RNase水。扩增程序为：60℃逆转录30分钟；95℃预变性5分钟；随后进行40个循环的94℃变性30秒和55℃退火延伸1分钟；最后98℃失活10分钟。实验需设置空白、阴性、阳性（EC RNA）和过程质控对照，要求空白和阴性对照无扩增，阳性对照结果在预期范围内，且MS2噬菌体的回收率必须大于或等于1%。
1.4典型案例
水体污水是柯萨奇病毒传播的重要来源。一项针对南非Umhlangane河和Umgeni河的监测在饮用水水源中检测到人类腺病毒、多瘤病毒以及甲型、丙型肝炎病毒和柯萨奇病毒等肠道病毒，约60%的样本含有病毒颗粒，提示长期饮用未经处理的河水可能带来感染风险，强调了对供水和污水的病毒监测与消毒的重要性[21]。2024年5–8月，巴勒斯坦西岸杰宁区暴发CV‑A16引起的手足口病[22]。该疫情共报告44例患儿，平均年龄约2.08岁（3个月至12岁），95%患儿年龄小于5岁，男女比例约0.9。全部病例口腔黏膜出现疱疹，95%手部、80%足部有皮疹，22.7%伴有腹泻，只有13.6%出现发热。样本检测显示81.8%阳性且均为CV‑A16 B1c亚基因型，无神经系统并发症。
在具体感染案例方面，2022年湖北省十堰市爆发手足口病流行，其中柯萨奇病毒A6（CVA6）为主要致病病毒[23]。另有报道，2019年2月，江苏省无锡市某制药厂发生成人集体感染事件。该厂共有238名员工，涉及13个部门，其中7个部门出现感染病例。事件发生后，相关部门对厂区进行了全面消毒，并加强了员工健康监测与防控措施[24]。
1.5防治对策
1、加强水源保护：
（1）确保饮用水源远离污染源，如工业废水、生活污水等。
（2）定期对水源进行监测，确保水质符合安全标准。
2、改善水处理工艺：
（1）采用先进的水处理技术，如过滤、消毒等，有效去除或杀灭水中的病毒和其他病原体。
（2）确保水处理设施的正常运行和维护，防止病毒在处理过程中逃逸。
3、加强水质监测和信息公开：
（1）建立完善的水质监测体系，对饮用水、水源水等进行定期监测。
（2）及时公开水质监测结果，提高公众对水质安全的认知度和参与度。
参考文献
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